Editorial
Los meses de enero y febrero, han sido meses de gran actividad gremial profesional en nuestro país, actividad que ha conllevado a una mejoría arancelaria importante en el área de diagnóstico. Representantes de nuestra actividad profesional han mantenido reuniones a nivel nacional, desde ya hace un tiempo, y que han comenzado a dar frutos tangibles recientemente. Creo, sinceramente, que este avance arancelario propiciará una mayor inversión en nuevas tecnologías de aplicación al diagnóstico Clínico, y contribuirá a mantener como horizonte, un avance en la calidad de prestación que facilite los mecanismos de certificación y acreditación de la calidad.
Desde ya mis felicitaciones y agradecimiento a todos aquellos colegas que han participado en estos procesos de negociación, desde sus inicios, y que han tenido como fin la defensa de nuestras profesiones.
Bioanálisis quiere estar presente y ser partícipe de este momento tan especial para la bioquímica y las demás profesiones del diagnóstico de laboratorio, y por ello en esta edición hemos dedicado un importante espacio, en el que la CUBRA da a difusión sobre estos avances. Como siempre retomamos temas de Calidad en el ejercicio del diagnóstico de laboratorio y de los avances en nuevas tecnologías de aplicación a nuestras profesiones, como: la HPLC, las Técnicas de Biología molecular y la Citometría de Flujo, entre otras tecnologías.
Dr. Sergio Sainz
Director de Revista Bioanálisis
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Nota 1: ¿Y si resolviéramos la hematología compleja en el mismo instrumento que realizamos la hematología de rutina?
Podríamos definir al Cell-Dyn SapphireTM como lo hace el manual del usuario: Un analizador hematológico automático y multiparamétrico, diseñado para el hemograma y su utilización en el diagnóstico in vitro.
En otras palabras, este instrumento de mesada, nos informa todos los parámetros incluidos en el hemograma utilizando diferentes tecnologías: Citometría de flujo, fluorescencia, impedancia y espectrofotometría. La muestra es agitada a través de su mezclador por inversión y aspirada por una única punta de toma muestra. El instrumento reporta 28 parámetros básicos pudiendo llegar a obtener 35 parámetros de cada muestra (sin incluir la información para uso exclusivo del laboratorio). En el proceso básico, reporta el estudio de los leucocitos en valores absolutos y porcentuales para las poblaciones normales de la serie blanca. Además, genera alertas ante la presencia de elementos inmaduros, cayados o elementos patológicos como pueden ser, por ejemplo: blastos. Todo esto a través de la tecnología MAPSSTM (Multi Angle Polarizad Scattergram Separation).
Utiliza impedancia y citometría de flujo para el recuento de glóbulos rojos y plaquetas obteniendo para estos parámetros un doble resultado que nos permite tener una absoluta confianza en el informe que estamos entregándole al paciente.
La detección y cuantificación de eritroblastos se ha convertido en un tema importante en el hemograma automatizado. Una característica sobresaliente del instrumento, es la capacidad de contar por fluorescencia los glóbulos rojos nucleados eliminando la necesidad de corrección del recuento de blancos en aquellas muestras que presenten dichos elementos.
Dentro de los métodos que utilizan fluorescencia, el ideal sería aquel económicamente viable que simultáneamente permita el análisis de leucocitos y glóbulos rojos nucleados dentro del hemograma de rutina. El método aplicado en el Cell-Dyn SapphireTM, utiliza el haz de láser de estado sólido de 488 nm. Se basa en la utilización de reactivos que causan la lisis de los glóbulos rojos causando cambios mínimos en los glóbulos blancos. Las células son expuestas simultáneamente a la acción del colorante Yoduro de Propidio (PI) que tiene la propiedad de diferenciar la permeabilidad de membrana de los glóbulos blancos. El PI tiñe los ácidos nucleicos de los núcleos expuestos de los glóbulos rojos nucleados. Los leucocitos viables se mantienen sin teñir. Los blancos no viables, son teñidos y resueltos por un algoritmo del software.
Nota 2: Análisis de Toxinas Ambientales y Alteraciones Metabólicas en orina por Inyección Directa en el Sistema HPLC-GC-ECD
El sistema KONIK K2 HPLC-HRGC ha sido validado satisfactoriamente como un método directo de análisis de pesticidas en muestras biológicas a niveles de trazas.
Es ampliamente conocido que la exposición a tóxicos medioambientales es causa de indeseables peligros y riesgos en la salud humana y animal. Por ello, la monitorización biológica para determinar la naturaleza y concentración de los tóxicos medioambientales (y/o sus metabolitos) directamente en los fluidos biológicos (sangre, suero, orina) se hace indispensable y, consecuentemente, diferentes tipos de métodos analíticos son necesarios para la estimación de la exposición humana a dichos compuestos.
El uso incorrecto de los plaguicidas puede plantear problemas graves para el hombre a corto y largo plazo: neurotoxicidad, carcinogenicidad, teratogenicidad, mutagenicidad, efectos en hígado, alteraciones hormonales, alteraciones del sistema inmunológico, efectos transplacentarios, etc. La población potencialmente expuesta no comprende a sólo los trabajadores agrícolas, ya que un uso incorrecto puede traducirse en problemas de contaminación medioambiental y extenderse a aquellas personas que se expongan por vía respiratoria al sobrepasar niveles máximos permitidos en el aire, o bien, por vía digestiva por consumo de alimentos con niveles de estas sustancias superiores a los admitidos.
La determinación de residuos de pesticidas en muestras biológicas requiere la aplicación de procedimientos de “clean-up”, tales como extracción Líquido-Líquido o extracción en fase sólida, con la finalidad de eliminar las interferencias y reducir los límites de detección de los compuestos de interés.
En este trabajo se propone un método para la determinación directa de Pesticidas Organoclorados en orina usando el sistema multidimensional K2 HPLC-HRGC (basado en la interfase patentada TOTAD). La combinación HPLC-HRGC prácticamente elimina la etapa de preparación de muestra, ya que la muestra se inyecta directamente en el HPLC sin otra etapa de pre-tratamiento que una simple filtración. Los pesticidas son retenidos en la columna de HPLC, mientras las sales y otras interferencias son eliminadas. A continuación, los OCPs son eluidos de la columna de HPLC y son transferidos al HRGC donde se llevará a término la separación y detección de los compuestos.
Nota 3: Control de la Calidad en la Determinación de Anticuerpos Anti-Nucleares por Inmunofluorescencia Indirecta, una materia pendiente
Los resultados de las pruebas serológicas para auto-anticuerpos, incluyendo la de anti-nucleares (ANA) y anticuerpos contra antígenos específicos como ser anti-DNA de doble cadena, son muy importantes en el diagnóstico de enfermedades reumáticas sistémicas. Muchas veces estos resultados pueden ser mal interpretados. Muy pocos de estos anticuerpos son patognomónicos para una enfermedad autoinmune reumática sistémica particular, como muchas veces los anticuerpos anti-virales sí lo son para enfermedades infecciosas. Por estas razones, el resultado de una prueba de ANA aislada, es insuficiente para establecer un diagnóstico. Resultados positivos son encontrados en pacientes sin patología reumática y aún en individuos jóvenes normales. Por lo tanto, muchas consideraciones técnicas son críticas para la correcta interpretación de los resultados, evitando así errores diagnósticos, terapias inapropiadas y un mal aprovechamiento de los recursos económicos en salud.
La primera prueba de laboratorio, descripta por Hargraves en 1948, que demuestra la presencia de anticuerpos anti-nucleares, es la prueba de las “Células LE”. Este fue el primer soporte de laboratorio con que contó el médico para el diagnóstico de lupus eritematoso sistémico (LES). Pero la escasa sensibilidad y especificidad de esta prueba llevó a los investigadores a intentar explicar este fenómeno, y guió a una serie de laboratorios al descubrimiento que el factor responsable del fenómeno de células LE era una familia de anticuerpos que reconocía diferentes constituyentes nucleares. Al final de la década del 50, fueron desarrolladas distintas pruebas utilizando la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y empleando como sustratos cortes criostáticos de tejidos (hígado y riñón) de roedores (rata o ratón). Comparado con la prueba de Células LE, la IFI se mostró mucho más sensible para el diagnóstico de LES. Sin embargo, esto fue acompañado con una disminución de la especificidad, y en un sustancial número de pacientes con otras enfermedades, aún en individuos sanos, se veía que la prueba de ANA por IFI era positiva. En un esfuerzo por reducir el número de falsos positivos o resultados clínicamente irrelevantes, los laboratorios comenzaron a reportar los títulos, esto es: la máxima dilución del suero en la que persistía la coloración nuclear fluorescente (reacción positiva). En general, los pacientes con LES presentaban títulos mucho más altos que los individuos normales o con otras enfermedades.
Nota 4: Plataforma de Cuantificación QUBIT Todo lo que Usted necesita para una cuantificación exacta
Muchos científicos han experimentado sorpresas y complicaciones en aplicaciones posteriores a sus cuantificaciones. Gran parte de esas complicaciones hubieran podido evitarse con una cuantificación exacta del DNA, RNA o proteínas de sus muestras. La cuantificación por espectrofotometría UV brinda una herramienta de valor, pero se debe tener en cuenta que el espectrofotómetro mide también otros componentes presentes en la muestra, además de los que al investigador le interesa cuantificar específicamente. Esto suele generar desvíos en la medición y acarrear graves problemas en las aplicaciones posteriores. Actualmente, esto puede resolverse de manera fácil, conveniente y rentable utilizando la Plataforma de Cuantificación Qubit que INVITROGEN ha lanzado al mercado.
La fluorometría provee SELECTIVIDAD
La Plataforma de Cuantificación Qubit consiste en un Fluorómetro Qubit y kits de Tecnología Quant-iT. Dichos kits emplean colorantes selectivos que se tornan fluorescentes cuando se unen al DNA, RNA o PROTEÍNAS (Tabla 1). Estos colorantes son específicos para sus targets y no se acoplan a contaminantes como fenol, sales, cloroformo y/o nucleótidos libres. El resultado es una lectura de fluorescencia que refleja exactamente la cantidad de producto que el investigador tiene interés en cuantificar (DNA, RNA o Proteínas).
Nota 5: Aplicación de PCR-RFLP para subtipificar Campylobacter jejuni
Desde que Vandamme en 1991 propuso a la familia Campylobacteraceae como superfamilia VI de acuerdo con los estudios de rRNA, unas amplias variedades de subespecies se definieron tanto en el género Campylobacter como en el género Arcobacter. Las especies C. jejuni y C. coli son una de las causas de enteritis aguda en humanos, siendo los animales domésticos y silvestres, en particular las aves, los reservorios de C. jejuni, y los cerdos de C. coli. Los alimentos de origen animal (carne de aves, cerdo) hacen de esta zoonosis una enfermedad transmitida por alimentos (ETA), entre otras maneras de transmitirse al humano.
Estas bacterias tienen escasa actividad bioquímica. Al no fermentar los hidratos de carbono, se utilizan pruebas de tolerancia a diferentes temperaturas, la prueba del hidrólisis del hipurato e hidrólisis del indoxil acetato, la sensibilidad a discos de 30 µg de ácido nalidíxico y cefalotina, y según la especie a identificar la tolerancia a diferentes concentraciones de sustancias como NaCl, glicina, etc. Son pocos los métodos fenotípicos (serotipificación, biotipificación, tipificación por fagos) que discriminen satisfactoriamente una especie o subespecie. Este inconveniente se exacerba porque todos ellos revelan una enorme diversidad.
Actualmente, la Biología Molecular aporta una amplia variedad de técnicas para subtipificar genotípicamente a Campylobacter spp. Algunas de ellas se basan en la digestión por enzimas de restricción de productos de PCR (PCR-RFLP), en la amplificación al azar del ADN polimórfico (RAPD), ribotipificación o la electroforesis en geles de agarosa con campo pulsado (PFGE). Dentro de la gran oferta de posibilidades de las técnicas de Biología Molecular, la elección depende del objetivo del trabajo y las posibilidades de poder acceder a ellas, pues requieren un equipamiento especial y altos costos en los elementos que se utilizan para realizarlas. A lo anterior habría que sumarle que no hay una prueba de oro incuestionable que se utilice como referencia, por lo que las variaciones en los resultados que se obtienen por las diferentes pruebas aplicadas dificultan su interpretación.
Nota 6: Sistema de Calidad dentro del Laboratorio de Análisis Clínicos
Casos de acreditación de la Norma ISO 15.189/2003
Según la Real Academia Española el término Calidad significa:
a) Propiedad o conjunto de propiedades inherentes a algo, que permiten juzgar su valor.
b) Buena calidad, superioridad o excelencia.
En el laboratorio moderno resulta indispensable tener en cuenta el término CALIDAD ya que el laboratorio es el productor encargado de resultados e informes de gran trascendencia para la atención del paciente. Esta es la razón por la cual los procesos de los análisis clínicos y sus resultados deben garantizar Calidad.
La norma ISO 15.189 acredita la calidad de los laboratorios de análisis clínicos tanto en las fases pre y pos-analítica, como los procedimientos no normalizados y las propiedades con valores nominales (como las descripciones de los grupos). Por este motivo, cualquier laboratorio que busque el reconocimiento de su competencia por vía de la acreditación, encontrará muy útil esta norma internacional.
El proceso supondrá un trabajo considerable sobre el sistema de gestión, rutinas, documentación y procedimientos. Además, requerirá que el personal tenga interés y brinde un soporte duradero. De esta forma, el resultado será un servicio más transparente, coherente y de mejora continua que beneficiará a los pacientes y al laboratorio.
En Roche Diagnostics Argentina hemos decidido dar apoyo a la acreditación de los Laboratorios de Análisis Clínicos a través de distintos organismos ya que creemos que éste es el camino correcto. A tal efecto, trabajamos brindando un servicio de soporte para actividades que constituyen los eslabones de calidad en dichas Instituciones. El soporte es para laboratorios que buscan la acreditación de distintas Normas. Por ejemplo, ISO 15.189 y CAP (Colegio Americano de Patólogos). También se brinda soporte documental para aquellos laboratorios que buscan la certificación de la Norma ISO 9.001 Edición 2.000.
En este camino dos laboratorios que han acreditado sus procesos bajo la Norma ISO 15.189/2003 nos brindan su experiencia. Entrevistamos a la Dra. Margarita Gabbarini (IACA Laboratorios) y a la Dra. María Eugenia Almagro (Laboratorio de Medicina) que nos explican detalles del proceso, expectativas y logros de dicha acreditación.
Nota 7: La Gestión de la Calidad en las Empresas Proveedoras de Equipos, Insumos y Servicios para los Laboratorios de Análisis Clínicos
Son muchas las empresas que, para posicionarse en mejor situación, tanto en el mercado nacional como internacional, deben mejorar su eficacia y eficiencia a través de la aplicación de sistemas de gestión de la calidad de reconocido prestigio internacional, con lo que logran ventajas competitivas e incrementan permanentemente la satisfacción de las necesidades de sus clientes, como así también de otros interesados (empleados, propietarios, sociedad, proveedores). Estas organizaciones iniciamos el CAMINO DE LA CALIDAD aplicando la norma ISO 9001:2000 en nuestros sistemas de gestión de la calidad para la mejora continua de nuestro desempeño. Algunas también utilizamos modelos para la autoevaluación respecto a los criterios del sistema de gestión de la calidad. Los más ampliamente reconocidos y empleados son los modelos de calidad tales como el EFQM europeo, el Malcom Baldrige americano o el Deming japonés. Éstos indican "qué" mejorar, pero en ningún momento "cómo" mejorar. La norma ISO 9.001:2.000 es una potente herramienta para la mejora continua de las organizaciones hacia la excelencia dado que especifica "cómo" mejorar hasta conseguir la excelencia. Esta norma incorpora los ocho principios de gestión de la calidad que los utiliza la alta dirección para liderar la organización en el camino de la mejora de la gestión y de los resultados. El nivel de crecimiento de las organizaciones y, por lo tanto, su nivel de competitividad, aumenta proporcionalmente con la experiencia en el uso de estos principios de gestión de la calidad y en el desarrollo de dichos requisitos, aumentando el nivel de madurez en el desempeño del sistema de gestión de la calidad, estableciendo objetivos medibles, planes de mejora y medir, parcial o totalmente, la mejora en el desempeño del sistema.
