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Revista Nº 67 Enero-Febrero 2016

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Agenda Arte Bioagenda

Diagnstico Bioqumico


Actividad antifúngica de melanina en cepas clínicas de Candida spp

Autor: Marisol Fuentes, Romané Hernández, Diego Gordillo, José Amaro, Mary A. Falconer, Claudio Alburquenque y Cecilia V. Tapia

ntroducción: Los melanocitos son células presentes en piel y en mucosas que sintetizan melanina, además de citoquinas. Es sabido que melanina presenta actividad antimicrobiana y que los melanocitos se melanizan al ser expuestos a moléculas microbianas. Objetivo: Estudiar la actividad antifúngica de melanina en cepas clínicas de Candida spp. Metodología: Se midió la concentración inhibitoria mínima (CIM) a melanina, de 4 cepas de Candida ATCC (C. albicans SC5314, C. parapsilosis 22019, C. glabrata 2001 y C. krusei 6258) y 56 aislados clínicos de Candida spp. (33 C. albicans, 12 C. glabrata, 3 C. famata, 3 C. krusei, 3 C. parapsilosis, 2 C. tropicalis) mediante un método de microdilución en caldo. Además se estudió el efecto antifúngico de lisados de melanocitos y células de melanoma de ratón en C. albicans. Resultados: Melanina inhibió las cepas analizadas, incluso cepas susceptibles dosis-dependiente y resistentes a fluconazol, siendo los rangos de CIM y CIM50 de 0,09-50 µg/mL y 6,25 µg/mL, respectivamente. Los lisados de células pigmentadas inhibieron C. albicans. Conclusiones: Melanina es capaz de inhibir cepas clínicas de Candida spp. La melani-zación podría ser un importante mecanismo protector de los melanocitos.

Palabras clave: Melanina, melanocito, actividad antifúngica, Candida spp.

Introducción

Los melanocitos son células den-dríticas derivadas de la cresta neural que se localizan en el estrato basal de la epidermis interactuando con los queratinocitos en una razón de 1:30. Su principal función es la síntesis de un pigmento denominado melanina (1,2).

Melanina es el nombre que recibe un amplio grupo de pigmentos con propiedades similares que se encuentra en la mayoría de los seres vivos; son polímeros de alto peso molecular muy estables, con polaridad negativa, hidrófobos e insolubles en agua (3,4).

Los pigmentos de melanina se forman por polimerización oxidativa de compuestos fenólicos; en los melanocitos humanos se producen principalmente DOPA-melaninas, también denominadas eumelaninas, las cuales se caracterizan por ser pigmentos de color oscuro (5). La melanogénesis es un proceso que ocurre en organelos especializados llamados melanosomas, que se forman en el aparato de Golgi. Una vez sintetizada la melanina, ésta es transferida a los queratinocitos mediante exocitosis (1,2,6,7).

Actualmente, no se conoce comple-tamente el rol de la melanina en la piel y otros tejidos animales (8). La principal función de la melanina en la piel humana parece ser la protección frente a los radicales libres formados por la radiación UV (9,10). Sin embargo, existen estudios que rechazan esta hipótesis exponiendo que la melanina no resultaría efectiva por sÌ sola para evitar la formación de dímeros de pirimidina por radiación UV (10,11).

Con respecto a otras funciones que se le atribuyen a melanina, estudios posteriores han demostrado una relación genética y bioquímica entre los procesos de inmunidad y melanización (10). Dichos estudios han reportado que, tanto los melanocitos como la melanina, inhibirían la proliferación bacteriana y fúngica en la dermis y epidermis (12).

Las especies del género Candida son levaduras comensales que forman parte de la microbiota gastrointestinal y genital, aunque bajo ciertas condiciones pueden transformarse en patógenos, produciendo una infección llamada candidiasis. El agente etiológico más prevalente es Candida albicans; sin embargo, se han aislado otras especies como C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis y C. Krusei (13).

Existe evidencia que sugiere que en población de piel oscura existiría una mayor resistencia a infecciones por Trychophyton mentagrophytes y C. Albicans (14). Dados los antecedentes expuestos, en el presente trabajo se desea evaluar si la melanina sintética, lisados de melanocitos y células de melanoma, presentan actividad antifúngica en cepas clínicas de Candida spp.

Materiales y Métodos

Cepas

Se utilizaron cepas de Candida spp. ATCC (C. albicans SC5314, C. parapsilosis 22019, C. glabrata 2001 y C. krusei 6258) y 56 cepas provenientes de aislados clínicos de un cepario del Laboratorio de Clínica Dávila, las cuales fueron previamente identificadas a nivel de especie, mediante tubo germi-nativo, microcultivo y API 32CAUXTM (Biomerieux). Las cepas correspondieron a C. albicans (n: 33), C. glabrata (n: 12), C. famata (n: 3), C. krusei (n: 3), C. parapsilosis (n: 3) y C. tropicalis (n: 2). Se incluyeron en el estudio cepas susceptibles, susceptibles dosis dependiente (SDD) y resistentes a fluconazol. El uso de las cepas fue aprobado por el Comité de ética de Clínica Dávila.

Microdilución en caldo

Se realizó un ensayo de micro-dilución en caldo, adaptando el estándar EUCAST-AFST para medir la concentración inhibitoria mínima (CIM), utilizando distintas concentraciones de melanina sintética (Sigma-Aldrich ®). Se prepararon placas de RPMI 1640 2x a pH 7,0 con concentraciones máximas de melanina de 50 µg/mL. Las cepas se sembraron en agar Sabouraud y se incubaron a 37ºC durante 24 h. Posteriormente se preparó un inóculo de cada cepa (Mc Farland de 0,5) y se realizó una dilución 1:1000; luego se sembraron 100 µL de esta dilución en las placas de microdilución. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 h, en ausencia de luz. Finalmente, se realizó una lectura visual de las CIMs considerando el 50% de inhibición de crecimiento. Adicionalmente se tomaron 3 µL de muestra de los pocillos y se sembró en un agar Sabouraud para evaluar si la actividad inhibitoria es fungistática o fungicida.
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