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Revista Nº 64 Julio -Agosto 2015

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Agenda Arte Bioagenda

Diagnstico Bioqumico


Microproteínas urinarias en diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos

Autor: María Laura Facio(1), Norma Ferrari(2), Fernando Segovia(3), Pablo Bresciani(1), Fabio Lombardo(4), Susana Fraind(1), Mariel Alejandre(5), María del Carmen Maselli(1), Marcela Pandolfo(1), Silvia Gasparini(1), Margarita Angerosa(5), Marco Pizzolato(5),

En pacientes diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos se observa la presencia de Microproteínas Urinarias (MU) en el rango 68-25 KDa. El objetivo del trabajo fue identificar en distintos estadios de la nefropatía diabética si dicho rango corresponde a un marcador de daño tubular. Se estudiaron 119 orinas espontáneas de pacientes diabéticos tipo 2; se les midió la relación albúmina/creatinina urinaria y la creatinina sérica. Se dividieron en 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminú-ricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urémicos en pre-diálisis y 6 en hemodiálisis. Las MU se detectaron geles de poliacrilamida en 2 dimensiones para uso clínico y se analizaron con el programa Image J 1.30v. La iden-tificación de las MU se realizó por “immu-noblotting” o por espectrometría de masa MALDI-TOF-TOF. El 66% de los normoal-buminúricos presentaron las siguientes MU: orosomucoide, fragmento de 35 kDa de la cadena pesada H4 del inter alfa I inhibidor de tripsina y Beta Trace, las cuales no reflejaron daño tubular debido a que la concentración de las mismas no se incrementó en los pacientes en hemodiálisis, en comparación con los normoalbuminúricos. Dichas proteínas están vinculadas al endotelio vascular y podrían constituir un marcador urinario vascular-tubular renal de utilidad clínica en patologías sistémicas con riesgo cardiovascular y funcionalidad renal conservada.

Palabras clave: diabetes tipo 2 * nefropatía diabética * electroforesis bidimensional en orina * zinc-alfa2-glicoproteina * péptido LG3 * prostaglandina D2 sintasa * inter-alfa-tripsina inhibidor H4 * endotelio vascular

Agradecimientos

El presente trabajo fue realizado con el Subsidio de la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad de Buenos Aires (UBACyT-CB05).

Introducción
Las Microproteínas Urinarias (MU) son proteínas séricas que ultrafiltran a través del glomérulo y son reabsorbidas y catabo-lizadas, prácticamente en su totalidad, en el túbulo contorneado proximal (TP). Frente a una disfunción del TP las MU se eliminan por orina. La detección de alguna de ellas permite caracterizar el tipo de proteinuria, siendo de utilidad como marcadoras de daño tubular. Entre las proteínas que pueden evaluarse proteína (A1m), la proteína transportadora del retinol (RBP) y la beta-2 microglobulina (B2m). También existen otras MU que no son marcadoras de daño tubular porque son influenciadas por otros factores, como por ejemplo, las cadenas livianas libres de inmunoglobulinas policlonales.

El perfil de excreción de las MU se modifica dependiendo de la patología que lo origina o del mecanismo involucrado en el daño renal (1-4). La detección de proteinuria tubular es de importancia diagnóstica ya que puede preceder a la glucosuria, aminoa-ciduria o fosfaturia, y a menudo es el primer y único signo de disfunción tubular (5).

El compartimento tubulointersticial es afectado en forma primaria o secundaria y es un importante factor pronóstico de enfermedad renal. En las alteraciones renales primario del proceso patogénico, la etiología es variable e incluye procesos obstructivos, infecciones, tóxicos (inclu-yendo medicamentos), isquemia, enfermedades metabólicas (como diabetes, hiperuricemia), radiación, daño mediado por mecanismos inmunes (como en rechazo del trasplante renal) e infiltración en enfermedades linfoproliferativas (6). En las enfermedades glomerulares y vasculares de acuerdo al tiempo de evolución y la severidad de las alteraciones, se puede observar desde daño tubular agudo, hasta atrofia, edema, inflamación tubular, o fibrosis intersticial. El daño tubular o intersticial agudo asociado a estas enfermedades puede manifestarse como insuficiencia renal aguda, y el daño crónico es un buen reflejo del avance de las lesiones irreversibles y, por lo tanto, un buen indicador pronóstico en enfermedades glomerulares y vasculares crónicas (7).

Las MU constituyen importantes indicadores de disfunción tubular en patologías glomerulares primarias y secundarias, donde los cambios túbulo intersticiales son consecuencia de la progresión de la falla renal. El daño tubular se puede presentar en desórdenes renales con proteinuria glomerular por el efecto adverso de la sobrecarga proteica y por la eventual actividad biológica que las mismas puedan ejercer en su microentorno (8).

La proteinuria en general es un factor de riesgo independiente de la progresión de la enfermedad glomerular crónica y está asociada a la extensión del daño hacia el túbulointersticio. Por lo tanto, es importante detectar una proteinuria tubular porque puede indicar un signo precoz inicial de daño tubular o la progresión del daño glomerular (8).

Actualmente, en el Laboratorio Clínico, el daño tubular se detecta por el método cualitativo de uroproteinograma con posterior inmunofijación con antisuero anti-beta 2 microglobulina (B2m). En estudios anteriores se concluyó que la sensibilidad del método es baja cuando se la compara con la cuantificación de B2m por inmunoturbidimetría (9). Además, es sabido que la B2m no debería ser la única proteína a evaluar en la definición del daño tubular debido a que no es estable en orinas ácidas (10). Otra proteína que podría ser cuanti-ficada en orina para definir daño tubular es la alfa 1 microglobulina (A1m), pero se reporta que la A1m, RBP y B2m son detectadas con diferente sensibilidad según el tipo de patologías, demostrando que la integridad funcional del TP puede estar comprometida por diferentes mecanismos (1).

Otro método para caracterizar el tipo de proteinuria, es la separación por peso molecular (SDS-PAGE), que permite definir proteinurias glomerulares y/o tubulares pero no puede ser utilizado para definir una proteinuria “tipo mielomatosa”. La separación de MU por SDS-PAGE ofrece una mayor resolución que el uroproteinograma. A grandes rasgos define dos tipos de “proteinuria tubular”, uno con proteínas desde 68 a 12 kDa y otro desde 68 a 25 kDa (11). Boesken et al. ya lo habían caracte-rizado con el nombre de tipo I micromo-lecular asociada con disfunción tubular severa/crónica (nefritis intersticial, epi-sodios de rechazo de trasplante renal) y tipo II macromolecular, frecuentemente asociada con proteinuria glomerular en gloméruloesclerosis hipertensiva/diabética, respectivamente (12).

Bazzi et al. También detectaros estas diferencias según los dos tipos de perfiles de Microproteínas I y II, en glomerulopatías primarias. Mostraron el valor predictivo de estos perfiles a la falla renal crónica. Pacien-tes con síndrome nefrótico y funcionalidad renal normal y Microproteínas tipo II presentaban mejor curva de sobrevida que los que tenían inicialmente el perfil de Microproteínas completo (Tipo I) (8).

Estos resultados motivaron a este grupo de trabajo a la realización de otros estudios, con el fin de resolver si ese perfil tipo II definía o no un daño tubular. Se concluyó que cuando por el SDS-PAGE se detectaba el tipo II, era perfil tubular, ya que cuantitativamente la A1m se encontraba elevada (11).

Además, se implementó el método de Electroforesis Bidimensional de utilidad clínica (2DUC) para abrir el espectro de MU, permitiendo visualizar un grupo de proteínas que no parecen responder a un patrón estrictamente glomerular o tubular (13).

La diabetes Mellitus (DBT) puede producir Nefropatía Diabética (ND), la cual es la responsable del 44% de la falla renal terminal en los Estados Unidos (14). En los estadios iniciales de la ND se producen alteraciones funcionales que se manifiestan clínicamente por la detección de micro-albuminuria. En estudios propios realizados en pacientes diabéticos tipo 2 con normoalbuminuria se observó la presencia de MU en un rango comprendido entre 68 y 25 kDa. El objetivo de este trabajo fue identificar dichas MU en pacientes con diabetes tipo 2 en distintos estadios de la ND con el fin de evaluar si dicho rango de MU corresponde a un marcador de daño tubular.

Materiales y Métodos

MUESTRAS

Se procesaron 119 muestras de orina espontánea de pacientes con diabetes Mellitus tipo 2. A 111 orinas se les midió la relación albúmina/creatinina urinaria y creatinina sérica en un equipo de Roche-Alemania, Cobas C501 (Tokio, Japón). Se dosaron: albúmina (inmunoturbidimétrico) y creatinina (Jaffé cinético con compen-sación y blanco de muestra) Los pacientes fueron distribuidos en 5 grupos según el siguiente diseño clínico: 71 normoal-buminúricos (Grupo 1, menor de 30 mg de albúmina/g de creatinina urinaria), 28 microalbúminuricos (Grupo 2, entre 30-300 mg/g) y 12 macroalbuminúricos (Grupo 3, mayor de 300 mg/g). De las 119 muestras de orina, 2 pertenecían a pacientes urémicos en estado de pre-diálisis (Grupo 4), y 6 a pacientes en hemodiálisis (Grupo 5).

PROCEDIMIENTO

A todas las muestras de orina se les realizó el método de SDS-PAGE con coloración argéntica (15) y se clasificó la proteinuria según el siguiente esquema: Fisiológica, sólo cuando se observó la banda de albúmina (68 kDa); MU tipo I (perfil completo, entre 68-12 kDa); MU tipo II (perfil incompleto, entre 6825 kDa); Glomerular, albúmina y transferrina; Perfil Mixto incompleto (Glomerular y MU II), Perfil Mixto completo (Glomerular y MU I). Se realizó la electroforesis bidimensional para uso clínico (2D UC) a cinco orinas, cada una representativa de un grupo junto con un control interno. La electroforesis 2D UC consta de una primera separación electroforética en acetato de celulosa gelatinizado (Cellogel-Biosystem), buffer veronal pH 8,6; Fi 0,05 (Helena) y una segunda dimensión en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12,5% de concentración final. Los geles se corrieron en Mini protean 3 System Bio-Rad, buffer de corrida continuo Tris glicina con SDS (13). A ambos lados de cada 2D UC se corrieron en una dimensión de SDSPAGE, la misma muestra y el control interno, este último corresponde a una orina con patrón tubular completo, como control de coloración y para analizar los “spots” en las distintas 2D UC.

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS:

– “Immunoblotting” con antisueros específicos anti: IgG (Beckman), Albúmina (Beckman), Alfa 1 antitripsina (Beckman), Orosomucoide (Dako), Alfa 1 micro-globulina (Beckman), cadenas livianas de inmunoglobulinas Kappa (Biocientifica), cadenas livianas de inmunoglobulinas Lambda (Biocientífica), Beta 2 micro-globulina (Dako) y como segundo anticuerpo anti-IgG de cabra o conejo (Sigma) marcado con peroxidasa, según correspondiese.
– Espectrometría de masa (MS): Se procesó un spot coloreado con tinción argéntica y un blanco del mismo gel. Se digirió in gel utilizando tripsina como enzima proteolítica. El extractivo de cada una de las muestras se sometió a análisis en el Espectrómetro de masa tipo –MALDI-TOF-TOF, modelo 4800 plus de ABSciex (Concord, Canadá). Los datos fueron obtenidos en Modo Reflectron, seguido de la fragmentación de las señales más importantes. Se utilizó el programa Mascot PMF para la identificación de las proteínas a través de las masas moleculares de los péptidos (M+H+). Para el análisis de los espectros MS/MS se utilizó el programa MS/MS Ion Search de Mascot y el programa Paragom de Protein Pilot.

EVALUACIÓN DE GELES DE ELECTRO-FORESIS BIDIMENSIONAL

Se procedió a escanear los geles. Mediante el programa analizador de imágenes Image J versión 1.3v se analizaron los “spots” de las muestras, relativo a la banda de 25 kDa del control interno, que permitió corregir las inevitables variaciones en las coloraciones que se observan entre geles. De cada mancha se obtuvo el valor relativo de Absorbancias (R). Cabe destacar que la variable R tuvo relación directa con la concentración de cada spot ya que en todos los geles se sembró la misma cantidad de muestra.

Resultados

El 66% de los pacientes normoal-buminúricos presentaron por el SDS-PAGE, MU entre 68-25 kDa con funcionalidad renal normal (Tabla I) (Fig. 1A).

En la figura 2 se observan orinas de pacientes con diabetes tipo 2 normo, micro y macroalbuminúricos sin MU.

Se realizó el “immunoblotting” a una orina de un paciente en hemodiálisis que presentaba perfil mixto completo, donde se confirmó la identificación de proteínas cuya presencia ya es conocida en la orina (Fig. 3). La identificación de la banda de 20 kDa, que corresponde a la proteína que liga el retinol (RBP), fue confirmada por espectrometría de masa (Tabla II).

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