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Revista Nº 58 Julio - Agosto 2014

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Investigacin Agenda Arte Bioagenda

Investigacin


Susceptibilidad antimicrobiana y diseminacin policlonal de cepas de Staphylococcus aureus

Autor: Maribel J. Castellano, Armindo J. Perozo, Ana M. Parra, Messaria M. Ginestre y Gresleida C. Rincn Escuela de Bioanlisis. LUZ. Maracaibo-Venezuela. Ctedra de Bacteriologa General (MJC, MMG). Ctedra de Bacteriologa Clnica (GCR). Centro de Refere

Resumen

Objetivo: Determinar la prevalencia de Staphylococcus aureus resistente a metici-lina (SARM), su patrn de susceptibilidad antimicrobiana y tipificar las cepas mediante electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP). Materiales y Mtodos: 106 cepas de S. aureus aisladas de pacientes recluidos en un hospital universitario de la ciudad de Maracaibo, Venezuela, fueron procesadas durante el primer trimestre del 2009. El cultivo, aislamiento e identificacin de las cepas se hizo por los mtodos conven-cionales. La susceptibilidad antimicrobiana fue determinada por el mtodo de difusin con disco. Se verific la presencia del gen mecA en las cepas de SARM mediante la reaccin de polimerasa en cadena (RPC). Resultados: Cincuenta y cuatro cepas (50,9%) eran SARM y se detectaron veintitrs antibiotipos, siendo el que incluye β-lactmicos, macrlidos, lincosamidas, aminoglucsidos y quinolonas, el ms frecuentemente observado (55,5%). Hubo cuarenta aislados (74,0%) multi-resistentes entre las cepas de SARM. Todas las cepas resistentes a meticilina fueron positivas para mecA. Por EGCP, las cepas de SARM fueron clasificadas en 50 pulsotipos, segn el perfil de cortes obtenidos, conteniendo cada uno, entre seis y trece bandas. Cuatro grupos, de dos cepas cada uno, fueron detectados con 80% de similitud. Cinco de las ocho cepas en estos grupos (62,5%) tenan el mismo patrn de resistencia. Conclusin: En el hospital, existe una alta prevalencia de cepas SARM multi-resistentes con difusin policlonal.

Palabras clave: Staphylococcus aureus, meti-cilina, resistencia, electroforesis en gel de campo pulsado.

Introduccin

Mundialmente, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) se ha convertido en el patgeno intrahospitalario ms significativo, siendo capaz de producir un amplio rango de infecciones y sndromes clnicos asociados con enfermedades graves, como bacteriemia, neumona, endocarditis, artritis sptica, osteomielitis y la formacin de abscesos profundos, entre otros(1). Debido a su gran capacidad de diseminacin, es necesario implementar programas efectivos de vigilancia para la identificacin y control de cepas epi-dmicas(1,2). SARM suele ser resistente a todas las penicilinas, carbapenmicos y cefalosporinas. Los agentes antimicrobianos con actividad anti-SARM varan entre hospitales, ya que cada centro de salud puede tener su propio patrn de suscep-tibilidad. El conocimiento de la relacin clonal de SARM y sus patrones de susceptibilidad antimicrobiana puede contribuir a los esfuerzos de control de infecciones hospitalarias en la supervisin y limitacin de su propagacin al interior de y entre hospitales(2,3).

Sin dudas, en los ltimos aos, el amplio uso de antimicrobianos ha acelerado la evolucin de S. aureus y conducido a la aparicin de cepas que han adquirido sistemticamente mltiples determinantes genticos de resistencia(4). Con el surgi-miento de estos aislados multi-resistentes en los hospitales por un lado y, por el otro, la diseminacin a la comunidad de cepas hipervirulentas de SARM, este microorga-nismo ha evolucionado muy rpidamente y ha creado nuevos problemas clnicos(2,4).

Una de las formas eficientes para estudiar la propagacin de SARM es a travs de la determinacin de las caractersticas genotpicas de los clones, as como el parentesco gentico de las cepas en dife-rentes regiones geogrficas(2,5-7). En los ltimos aos, se han utilizado una variedad de tcnicas moleculares para la tipificacin de las cepas de SARM(8). De stas, el anlisis de macro-restriccin mediante electro-foresis en gel de campo pulsado (EGCP), utilizando la enzima SmaI es el estndar de oro para el anlisis de la epidemiologa local a corto plazo(6,9,10).

Hasta hace poco se afirmaba que la diseminacin de SARM era consecuencia de la propagacin global de pocos clones altamente epidmicos(11); sin embargo, estudios recientes han mostrado evidencias de que la poblacin de SARM est geogr-ficamente estructurada y que puede haber surgido frecuentemente, en diferentes partes del mundo, gracias a incorporaciones independientes de determinantes de resistencia a meticilina en su genoma(2,12). En consecuencia, para comprender mejor la emergencia y difusin global de SARM es til obtener informacin acerca de la epide-miologa local. Lamentablemente, hasta la fecha, los trabajos en relacin a la epide-miologa molecular de SARM en el rea son muy escasos.

Obedeciendo a esta inquietud, se realiz la presente investigacin cuyos obje-tivos fueron: determinar la prevalencia de SARM; determinar los perfiles de susceptibi-lidad antimicrobiana en cepas de S. aureus aisladas de pacientes hospitalizados y tipificar las cepas mediante EGCP para esta-blecer el posible origen clonal de las cepas de SARM, informacin relevante para el personal de salud y los comits de vigilancia y control de las infecciones intrahospitalarias para implementar los programas y estra-tegias de intervencin en salud.

Materiales y Mtodos

Cepas bacterianas

Se estudiaron 106 cepas de S. aureus aisladas de diferentes muestras clnicas provenientes de pacientes inter-nados en un hospital universitario de la ciudad de Maracaibo, Venezuela, durante el primer trimestre del ao 2009. El cultivo, aislamiento e identificacin bacteriana se efectu acorde a la metodologa convencional. De todo paciente incluido en esta investigacin se obtuvo el consen-timiento informado por escrito. En el caso de los menores de edad, se solicit la autorizacin de sus padres o representantes. El nombre se mantuvo en el anonimato para garantizar la privacidad de los pacientes. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo a las normas establecidas por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) y el Cdigo de Bioseguridad y Biotica de la Repblica Bolivariana de Venezuela en su tercera edicin(13). Se cont adems, con la autorizacin del Comit de tica del hospital.

Determinacin de los fenotipos de resis-tencia antimicrobiana

Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana fueron realizadas fenot-picamente mediante el mtodo de difusin con disco en agar, siguiendo las directrices del Instituto para la Estandarizacin de Laboratorios Clnicos(CLSI)(14). Los discos de antimicrobianos probados fueron: β-lactmicos: penicilina G (10 U); oxacilina (OX, 1 μg); y cefoxitin (FOX, 30 μg); minoglu-csidos: amikacina (AK, 30 μg) y gentamicina (GM, 10 μg); quinolonas: ciprofloxacina (CIP, 5 μg); gatifloxacina (GAT, 5 μg) y levoflo-xacina (LEV, 5 μg); diaminopirimidinas: cotri-moxazol (STX, 1,25/23,75 μg); cetlidos: teli-tromicina (TEL, 15 μg); lincosamidas: clinda-micina (CC, 2 μg); macrlidos: eritromicina (E, 15 μg); estreptograminas: quinupris-tin/dalfopristin (QDA, 15 μg); oxazolidino-nas: linezolid (LZD, 30 μg); glicopptidos: tei-coplanina (TEC, 30 μg); fenicoles: cloranfe-nicol (C, 30 μg); tetraciclinas: tetraciclina (TE, 30 μg); rifamicinas: rifampicina (RA, 5 μg); glicilglicinas: tigeciclina (TGC, 15 μg); otros: fosfomicina (FOS, 50 μg) y mupirocina (MUP, 5 μg). Para la interpretacin de los resultados de FOS, se utilizaron los criterios estable-cidos por Gobernado(15) y para MUP, los descritos por la Sociedad Britnica para Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC)(16); para el resto de los antimicrobianos se utilizaron los criterios de interpretacin del CLSI14. Para el control de calidad de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, se utilizaron las cepas de S. aureus ATCC 25923 (sensible a todos los antimicrobianos) y S. aureus ATCC 43300 (resistente a oxacilina-meticilina).

Para la antibiotipia (determi-nacin de los fenotipos de resistencia), cepas resistentes e intermedias fueron tratadas de manera indistinta. Aislados con resistencia, al menos, a un (1) agente antimicrobiano fueron considerados de un fenotipo distinto a aquellos completamente susceptibles.

Deteccin del gen mecA mediante la reaccin de polimerasa en cadena (RPC): La extraccin de ADN de colonias de S. aureus se llev a cabo utilizando un procedi-miento de lisis enzimtica y la deteccin del gen mecA por RPC se efectu de acuerdo a la metodologa descrita por Martineau y cols(17).

Tipificacin de las cepas SARM por electro-foresis en gel de campo pulsado: Para la tipificacin molecular de las cepas SARM se utiliz el equipo GUEFAST 06 de Neu-ronic, S.A. y para la obtencin del ADN genmico de bacterias intacto e inmovi-lizado, se utiliz el BACKIT (Neuronic, S. A)(18), acorde a las instrucciones del fabri-cante. Los perfiles obtenidos mediante la electroforesis fueron comparados mediante anlisis computarizado, utilizando el software GUEFASCAN, provisto con el equipo.

Anlisis estadstico

Para el registro de la informacin y la determinacin de los perfiles de resis-tencia antimicrobiana se utiliz el programa WhonetTM, versin 5,6 (World Health Organization). Para el estudio de la relacin clonal se utiliz el programa SPSS para Windows, versin 20, realizando el anlisis cluster jerrquico para clasificar las cepas de SARM estudiadas en grupos, de acuerdo a sus semejanzas y diferencias. Un cluster fue definido como un conjunto de patrones de bandas con ms de 80% de similitud. Se utiliz una significancia del 5% (α = 0,05).

Resultados

La distribucin de las cepas de S. aureus aisladas segn el tipo de muestra se muestra en la Figura 1, encontrndose una mayor cantidad de cultivos positivos a partir de secreciones varias (52 cepas, 49,0%); seguido de sangre y heridas quirrgicas con 13 cepas en cada caso (12,2%); aspirados traqueales con 12 cepas (11,3%); abscesos con 8 cepas (7,5%); catteres centrales 3 cepas (2,8%); lavados bronquiales 3 cepas (2,8%) y, una cepa (0,9%) para muestras de orina y exudado farngeo, respectivamente. De las 106 cepas de S. aureus estudiadas, 54 (50,9%) resultaron resistentes a meticilina, tanto con el disco de OX como con el de FOX y, 52 (49,0%), sensibles a este antimi-crobiano. Los porcentajes de resistencia antimicrobiana en cepas de S. aureus fueron: 97,1% de resistencia a PG (n: 103 cepas); 50,9% a OX (n: 54); 43,3% a E (n: 46); 39,6% a TEL (n: 42); 35,8% a CIP (n: 38); 34,9% a CC (c: 37); 34,9% (n: 37) para cada uno de los aminoglucsidos ensayados (AK y GM); 29,2% (n: 31) a LEV; 28,3% a GAT (n: 30); 9,4% (n: 10) a TE; 1,8% a C (n: 2 cepas); 0,9% a RA (n: 1) e igual porcentaje para STX. Adicionalmente, se obtuvo 12,2% (n: 13) de cepas intermedias a E; 3,7% (n: 4) a LEV y GAT; 1,8% (n: 2) a C y TE y 0,9% (n: 1) a CIP y CC, respectivamente. No se observ resistencia para TEC, LZD, TGC, QDA, FOS y MUP.
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