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Revista Nº 57 Mayo - Junio 2014

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Investigacin Agenda Arte Bioagenda

Diagnstico Bioqumico


Comparacin de mtodos de extraccin de ADN en tejidos parafinados y utilidad para amplificacin por PCR

Autor: Javier Alonso Baena Del Valle*, lvaro Jos Ramos Moreno**, Claudio Jaime Gmez Alegra***, Doris Esther Gmez Camargo**** * Mdico, Residente de patologa. Programa Jvenes Investigadores e Innovadores Virginia Gutirrez de Pineda, Colciencias

Resumen

Los tejidos fijados en formol e incluidos en parafina son una fuente de material para hallazgos moleculares en el mbito clnico y cientfico, demostrndose que el ADN extrado de stos, es adecuado para amplificacin a travs de la reaccin en cadena de la polimerasa (RCP). En este estudio, se ensayaron tres mtodos de extraccin de ADN en tejidos incluidos en parafina, con el objetivo de comparar la eficiencia de estos para obtener ADN adecuado, adems se analiz su utilidad en amplificacin por RCP. Se emplearon tres muestras, correspondientes a una biopsia de pulmn, legrado endometrial y ganglio linftico, todas fijadas en formaldehido al 10% e incluidas en parafina. Utilizndose tres mtodos diferentes de extraccin de ADN (extraccin por salting out, mtodo modificado de Sambrook y kit comercial) El ADN obtenido se cuantific por espectrofotometra, adems se realiz electroforesis en gel de agarosa al 1%, para comprobar si el ADN era de buena calidad y se realiz RCP para el exn 3 del gen caveolina 1. Todos los mtodos dieron como resultado una buen producto de ADN genmico, observndose mayor cantidad y pureza en los mtodos de salting out y kit comercial, asimismo se obtuvo amplificacin del producto esperado por estos dos mtodos, no hubo buenos resultados con el ADN extrado por el mtodo modificado Preparation of Genomic DNA from Mouse Tails y Other Small samples, segn Sambrook. El ADN obtenido a partir de tejidos FFIP puede ser amplificado por varios mtodos, entre estos, la extraccin por salting out es til y con poca toxicidad, permite obtener ADN de buena calidad para amplificacin por RCP.

Palabras claves: ADN, aislamiento y purifi-cacin, adhesin en parafina, formaldehido, reaccin en cadena de la polimerasa.

Introduccin

Los tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFIP) son una gran fuente de material para hallazgos moleculares en el mbito clnico y cientfico, porque representan un material biolgico especfico de una enfermedad, permitiendo establecer correlacin entre aspectos moleculares, patognesis, pronstico clnico y tratamiento (Lehmann y Kreipe, 2001; Dedhia et al., 2007).

El ADN extrado de tejidos FFIP es adecuado para amplificacin a travs de la reaccin en cadena de la polimerasa (RCP) y existen muchos estudios que han demostrado la utilidad del anlisis gentico basado en RCP con tejidos FFIP (Akao et al., 1991; Sato et al., 2001), no solo para estudiar alteraciones del genoma humano, sino tambin para el diagnstico de patgenos de importancia como virus y bacterias, en los cuales las tcnicas de deteccin micro-biolgica convencionales pueden ser laboriosas y tomar varios das antes de obtener un resultado (Yang et al., 2004; Mahaisavariya et al., 2005; Dedhia et al., 2007).

El formaldehido al 10% es el fijador ms utilizado en los estudios histopatolgicos. Sin embargo, en algunos casos es difcil obtener grandes fragmentos de ADN a partir de tejidos FFIP debido a que el cido frmico generado en la solucin de formaldehido al 10%, el tiempo de fijacin y el periodo de almacenamiento de los tejidos en bloques de parafina afecta la calidad del ADN. Por ejemplo, durante la fijacin en formaldehido al 10%, este se transforma gradualmente en cido frmico, el cual hidroliza el ADN, generando extensa fragmentacin de los cidos nuclicos y pobres resultados en la amplificacin por RCP (Greer et al., 1994; Pavelic et al., 1996; Sato et al., 2001).

Los mtodos tradicionales para aislamiento de ADN de tejidos FFIP utilizan xilol como agente removedor de parafina, seguido de purificacin con fenol/clo-roformo, lo cual requiere mltiples pasos con una prolongada duracin y riesgo de contaminacin cruzada con otras muestras que se estn procesando al mismo tiempo (Howe et al., 1997; Yang et al., 2004).

En este estudio, se aplicaron tres mtodos para extraccin de ADN en una serie de tejidos FFIP, con el objetivo de comparar la eficiencia de estos para producir ADN de buena calidad y cantidad. Adems de evaluar la aplicabilidad del ADN extrado al realizar amplificacin por RCP.

Materiales y mtodos

Tipo de estudio
Estudio descriptivo transversal

Diseo experimental
Estudio cuantitativo experimental
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