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Revista Nº 56 Marzo - Abril 2014

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Investigacin Agenda Arte Bioagenda

Investigacin


Proteinuria: lesin estructural renal y comparacin de mtodos

Autor: Leticia Madalena (1), Marcela Pandolfo (2), Mara Laura Facio (2), Claudia Garlatti (2), Mariel Alejandre (1), Pablo Diego Bresciani (2), Margarita Angerosa (1), Marco Pizzolato (1) 1. Doctor en Bioqumica 2. Bioqumico * INFIBIOC -

Resumen

La proteinuria (PT-ur) es un mar-cador de enfermedad renal, sin un mtodo de referencia establecido. Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tincin argntica pueden identificarse de manera no invasiva perfiles proteicos urinarios (PPU) de tipo glomerular (G), tubular (Tc: completos, Ti: incompletos) y mixtos (GTc, GTi) con fines diagns-ticos/pronsticos y de evolucin. El objetivo del estudio fue determinar la prevalencia (P) de los PPU para cada nivel de PT-ur obtenido con cuatro mtodos diferentes, en pacientes con sospecha de lesin renal. Se procesaron 105 orinas de 24 h de recoleccin clasifi-cadas mediante tira reactiva (TR) y 2 pacientes con proteinuria de Bence Jones (PBJ)>2 g/L. La cuantificacin de PT-ur se realiz con cido sulfosaliclico (SSA) y Bradford (CBB) in-house; cloruro de benzetonio (BZT-Roche) y rojo de pirogallol-molibdato (PRM-Wiener)-Hitachi 917. Se realiz uroproteinograma y SDS-PAGE. Los cuatro mtodos presentaron correlacin significativa (p<0,05) para PT-ur y una comparacin de medias estadsticamente no-significativa en todos los niveles de TR. Para TR negativa (PT-ur en rango normal), la P del Ti fue del 33% y del 16% para GTi. En TR 1+/2+, el GTi de mediana selectividad present una P del 33%/30% y el GTc de 26%/57%, respectivamente, que se increment al 66% para TR 3+, con escasa-selectividad. Las PBJ presentaron valores estables mediante BZT, con diluciones manuales o realizadas por el equipo. La PT-ur mediante los mtodos de cuantificacin ensayados resultaron comparables y el BZT mostr PT-ur variables en presencia de PBJ dependiendo de la dilucin empleada. En todos los niveles de PT-ur fue posible iden-tificar la P de todas las lesiones estructurales con selectividades progresivamente com-prometidas.

Palabras clave: enfermedad renal * protei-nuria * gel de poliacrilamida con dodecilsul-fato de sodio * protena de Bence Jones * cloruro de benzetonio

Introduccin

El nivel de proteinuria (PT-ur) es un marcador y a la vez un mecanismo de enfermedad renal progresiva que ha sido incluido en la lista de determinaciones de rutina recomendadas para un grupo especial de pacientes (con hipertensin, diabetes, cncer, etc.). Esto se debe a que es de esperar que existan cambios en la cantidad de protena excretada antes de llegar a detectar cambios en la filtracin glomerular, que, finalmente, se eviden-ciarn con la determinacin del clearence de creatinina (1).

Debido a la gran variacin de la concentracin proteica urinaria a lo largo del da, que puede experimentar grandes fluc-tuaciones, se ha recomendado recolectar orina de 24 h para realizar la cuantificacin de PT- ur. Sin embargo, para evitar los errores en la recoleccin del espcimen, numerosos trabajos han comprobado que la determinacin de la relacin PT-ur/crea-tinina urinaria en muestras tomadas al azar representa una prueba de tamizaje sencilla para predecir un valor de proteinuria clnicamente relevante, con la concomitante recomendacin de realizar una consulta con un mdico nefrlogo (2). En cuanto a los niveles de corte utilizados para definir proteinuria, ya sea en una muestra al azar como en la de 24 h, se han reportado amplias variaciones que demostraran la necesidad de establecerlos en relacin a las distintas condiciones clnicas y a los grados de compromiso de la funcin renal en diversos estadios de enfermedad renal (3). De acuerdo con las recomendaciones de la National Kidney Foundation, un valor de 200 mg/g o menos por da para la relacin protenas/creatinina en orina (PT/CREAT ur) puede considerarse normal y lo mismo ocurre para un valor de menos de 30 mg/g por da para la relacin albmina / creatinina (Alb/CREAT ur) en orina espontnea (4). De todas maneras, una muestra de 24 h de recoleccin es preferible para realizar la cuantificacin, desde el punto de vista de la precisin del dato, la posibilidad de detectar los cambios en la concentracin de creatinina urinaria (que tambin tiene un ritmo especial) y para sacar conclusiones acerca de la progresin de la enfermedad renal (5).

La explicacin histrica del porqu de la asociacin entre mayor proteinuria y severidad de la glomerulopata se basa en la observacin de la velocidad de la cada del filtrado glomerular, que conducir a una falla renal terminal temprana (45 aos) para, por ejemplo, las reducciones de 5 mL/min/ao que suelen encontrarse para proteinurias basales entre 1-3 g/24 h, perfectamente subsanables con intervenciones terapu-ticas tempranas (6).

Adems, si bien ha existido un gran desarrollo metodolgico en cuanto a la automatizacin de los mtodos disponibles para la cuantificacin de PT-ur, todava ninguno cubre la gran variedad de posi-bilidades, ya sea en cuanto al tipo de protena presente, como a la concentracin de la misma, mientras que tampoco ningn calibrador ha resultado ser universalmente til (7). A esto debe agregarse que la propia calidad de la protena eliminada es nefro-txica debido a la llegada de macromo-lculas que en s mismas son capaces de lesionar el entorno tbulointersticial, en especial en los cuadros no selectivos, provocando la progresin hacia un dao parenquimatoso renal irreversible como un destino final que es independiente del tipo de dao inicial (8) (9). Es posible estudiar dichos cambios mediante electroforesis, determinando perfiles de eliminacin en distintas patologas. La tcnica de electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) seguida de coloracin ultrasensible (10) es una metodologa no invasiva que identifica perfiles proteicos urinarios (PPU) glome-rulares (G), tubulares (Tc: completos, Ti: incompletos) y mixtos (GTc, GTi) con fines diagnsticos, pronsticos y de evolucin (11).

El objetivo del presente trabajo fue determinar la prevalencia (P) de los PPU para cada nivel de PT-ur y su comparacin con cuatro mtodos de cuantificacin, en pacientes con sospecha de lesin renal.

Materiales y Mtodos

Se procesaron todas las orinas de 24 h de recoleccin (105) remitidas al Laboratorio Central del Hospital de Clnicas en un periodo de dos meses, agrupadas de acuerdo a la reactividad de la tira reactiva (Combur _10 Test). Con el propsito de evaluar el comportamiento de las cadenas livianas libres monoclonales se incorporaron pacientes con proteinuria de Bence Jones (PBJ) superior a 2 g/L detectadas mediante inmunofijacin con antisueros monoes-pecficos anti kappa y anti lambda (Biocien-tfica-Argentina). Se realiz el anlisis completo de sedimento, se determin pH, turbidez y presencia de hemoglobina como probables interferentes. Los mtodos accesibles para el Laboratorio Clnico que se utilizaron para cuantificar PT-ur fueron: el de Exton, cido sulfosaliclico (SSA) y el de Bradford con azul brillante Coomassie G-250 (ABC), ambos con reactivos preparados in house y de desarrollo manual; el mtodo de Cloruro de Benzetonio (BZT) (Roche-EE.UU.) y el de Rojo de Pirogallol-Molibdato (RPM) (Wiener-Argentina), que se procesaron en un autoanalizador Hitachi-917 (Roche-EE.UU.). Se realiz el uroproteinograma electrofortico (URO) mediante electro-foresis convencional y la separacin en geles de poliacrilamida en presencia de agentes desnaturalizantes (SDS-PAGE) sin concen-tracin previa de las muestras.

Para definir el PPU tubular la presencia de una banda en posicin post-beta 2 globulinas en el URO fue confirmada mediante inmunofijacin (12).

ANLISIS ESTADSTICO

La comparacin de las medias para las variables cuantitativas se realiz median-te el Anlisis de Varianza (ANOVA/MANO-VA). Se utiliz la transformacin logartmica de los resultados para ajustarlos a una distribucin normal. Las diferencias significativas de las medias entre grupos en el caso del ANOVA paramtrico se evaluaron mediante el test de Tukey o de la mnima diferencia significativa y el de Student-Newman-Keuls; y en el correspondiente no paramtrico, el test de Dunn. Para los estudios de correlacin, se efectu el test de Spearman. Tambin se utiliz el test de independencia de variables (test de la G)- GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software- CA EE.UU). En todos los casos se consider significativa una probabilidad menor o igual a 5%.

El estudio ha sido aprobado en el marco del Proyecto B102 por el Comit de tica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad de Buenos Aires (Exp 709307/07) de acuerdo con la declaracin de Helsinki, World Medical Association (WMA) (1964-Helsinki, 1975-Tokyio, 1983-Venice, 1989-Hong Kong, 1996 - Somerset West, 2000-Scotland, 2002-Geneva, 2004-Tokyo Japan, 2008 Seoul, Korea).

Resultados

La PT-ur present niveles de corre-lacin significativos entre los cuatro mto-dos (p<0,05) ya sea cuando fue analizada en todo el rango de valores presentado por las muestras en estudio (0-10 g/L), as como tambin cuando fue clasificada en rangos tal como se observa en la Tabla I. Cuando se asign un puntaje de 0 a 2 para cada correlacin tomando como lmites: deseables (r: mayor o igual a 0,895) y mnimo aceptable (r: 0,880), el anlisis de las correlaciones entre los cuatro mtodos permiti determinar que se obtena un mximo valor en la comparacin de ambos mtodos automatizados (BZT vs RPM). El segundo mejor puntaje obtenido result entre los mtodos de SSA y BZT, con una correlacin no adecuada para niveles de hasta 1 g/L y valores idnticos en el resto de los niveles de PT-ur (Tabla II).

La comparacin de las medias mostr diferencias estadsticamente no significativas en todos los niveles de PT-ur agrupados de acuerdo a los resultados de la tira reactiva TR (Tabla III).

Un 14,5% de las muestras ana-lizadas que mostr un aspecto turbio present una media en la concentracin de PT-ur de 2,69 g/L (rango: negativo-8,7 g/L) para el mtodo SSA, y de 2,05 g/L (rango: 0,03-8,8 g/L) para BZT (r2=0,9529, p>0.05), con un PPU predominantemente GTc (65%).
El anlisis de las muestras estudiadas de acuerdo a un valor de pH menor de 5 (23%), pH 5 (24%) y mayor a 5,5 (53%) demostr que los mtodos SSA y BZT no presentaron diferencias estadsticamente significativas para las medias de los valores de PT-ur obtenidos, que a su vez evidenciaron todas las posibilidades de PPU en todos los rangos de pH (NS).
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