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Revista Nº 52 Julio - Agosto 2013

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Investigacin Gacetilla Agenda Arte Bioagenda

Diagnstico Bioqumico


Estudio del semen humano: implementacin de un mtodo objetivo*

Autor: Patricia Haydee Chenlo1, Julia Irene Ariagno2, Mercedes Norma Pugliese1, Herberto Ernesto Repetto3, Lydia Melba Sardi Segovia4, Gabriela Ruth Mendeluk5, Susana Mercedes Curi2

Introduccin

Los parmetros bsicos del estudio del semen, movilidad, morfologa y concen-tracin, son mediciones realizadas en toda la poblacin de espermatozoides eyaculados, por tal razn dichos parmetros no son capaces de garantizar la capacidad fertilizante de los pocos gametos que llegan al sitio de la fecundacin; sin embargo, proporcionan informacin esencial sobre el estado clnico de un individuo y constituyen una herramienta til para inferir la funcin reproductiva del varn. El mtodo de anlisis, como toda determinacin del laboratorio, debe cumplir con ciertos requisitos para que sea vlido y pueda ser aplicado a la clnica.

El estudio se encuentra estanda-rizado por normativas de la Organizacin Mundial de la Salud (1) y garantizado mediante el uso de controles internos (2) y programas de evaluacin externa (3), cumplimentando con los requisitos de calidad propuestos. Sin embargo, es un mtodo subjetivo, estudia los hechos y fenmenos mediante observaciones personales, lo que puede producir elevada imprecisin. Por tal motivo, en la actualidad hay una tendencia a objetivar los estudios bioqumicos.

Diferentes empresas producen Sistemas Computarizados de Anlisis de Semen conocidos como CASA (computer aided sperm analysis), instrumentos capaces de medir la movilidad y la cintica espermtica e incluso de estimar su concentracin (1). La ventaja que aportan estos sistemas objetivos es su alta precisin y la posibilidad de proveer datos cuantitativos de parmetros cinticos del espermatozoide (4). Diferentes factores pueden afectar el rendimiento de los instrumentos CASA, como la preparacin de la muestra, el nmero de fotogramas por segundos, la concentracin espermtica y la profundidad de la cmara. A pesar de eso se pueden obtener resultados confiables y reproducibles si se siguen los procedi-mientos apropiados que se encuentran disponibles en la literatura. Sin embargo, para asegurar la calidad de las mediciones estos mtodos deben ser validados y estandarizados, lo que an no ha sido suficientemente reportado. Se entiende por validacin, segn la CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), a todas las acciones destinadas a probar que un determinado proceso, sistema, equipa-miento o mtodo trabaja de la manera esperada y logra los resultados propuestos. Las normativas internacionales establecen que los- mtodos analticos empleados por el laboratorio deben estar perfectamente validados y que toda la informacin referida a su desempeo (exactitud, imprecisin, linealidad) debe estar debidamente registrada (5).
El objetivo del presente trabajo fue estandarizar y validar un sistema CASA para los mdulos de movilidad y concentracin.

Materiales y Mtodos

Se emplearon para la validacin muestras de semen provenientes de la labor asistencial del Laboratorio de Fertilidad Masculina, FFyB UBA, en el perodo 2009-2010 procesadas de acuerdo con la estandarizacin OMS 1999 (6).

1. Mtodo subjetivo: La movilidad fue efectuada por duplicado a 37 C (platina termostatizada) por la evaluacin de un mnimo de 200 espermatozoides, utilizando como cmara, porta y cubreobjeto, en condiciones para alcanzar una altura de 20 m. Se inform mviles progresivos rpidos (Grado a), mviles progresivos lentos (Grado b), mviles no progresivos (Grado c) e inmviles (Grado d).

El recuento espermtico se llev a cabo empleando cmara de Neubauer Improved por duplicado, considerando al menos 200 elementos y se inform en millones/mL.

El laboratorio tiene implementado el control de calidad interno a travs del monitoreo de medias mensuales y participa del programa de Evaluacin Externa de la Calidad (PEEC) de la Fundacin Bioqumica Argentina (FBA), de carcter semestral (7).

Los estudios fueron llevados a cabo por operadores calificados.

2. Mtodo Objetivo: El laboratorio cuenta con un sistema CASA, denominado SCA (Sperm Class Analyzer, Microptic S.L., Barcelona, Espaa), integrado por los siguientes componentes:

Hardware: ordenador, cmara digital de video Basler (Vision-Technology, Alemania), 25 imge-nes por segundo, microscopio ptico de contraste de fase positivo Nikon E-200 (Japn) con platina termostatizada a 37 C.

Software: SCA. Programa informtico compuesto por distintos mdulos: movilidad y concentracin, morfologa, control base de datos e informes, vitalidad, fragmentacin de ADN y contador celular.

El sistema SCA permite al operador cambiar las condiciones de medida y otorgar validez a las imgenes digitales.

ANLISIS DE CONCENTRACIN Y MOVILI-DAD

El anlisis de la concentracin y la movilidad, con el sistema CASA - SCA, se efecto en forma simultnea. Se capturaron un mnimo de 400 espermatozoides y por medio del software del SCA se analizaron 25 imgenes digitalizadas por segundo de cada espermatozoide de la muestra de semen. Se calcul para cada espermatozoide la velocidad curvilnea (VCL: velocidad promedio de una cabeza espermtica en su trayectoria curvilnea real), la velocidad rectilnea (VSL: velocidad promedio de una cabeza espermtica en su trayectoria rectilnea entre su posicin inicial y final) y la velocidad promedio (VAP: velocidad promedio de una cabeza espermtica a lo largo de su trayectoria promedio) (Figura 1).
Relacionando la VSL con la VCL y con la VAP se obtuvieron los ndices de progresin: Linealidad (LIN, linealidad de la trayectoria curvilnea, VSL/VCL) y Rectitud (STR, linealidad de la trayectoria promedio VSL/VAP).

Los datos obtenidos del sistema SCA requieren de una edicin por parte del operador, que consiste en verificar que la imagen analizada corresponda a una clula espermtica. En todas las muestras se llev a cabo este procedimiento por medio de un especialista altamente entrenado.

En base a las velocidades y sus respectivas progresiones, el software del equipo clasific a los espermatozoides en diferentes categoras, por velocidad, rectitud y linealidad en grados a, b, c y d.

A continuacin se detallan los diferentes ensayos realizados:

1. Para la categorizacin de los esperma-tozoides en grado (a) y grado (a+b) se trabaj con 20 muestras, las que fueron analizadas en forma simultnea por velocidad curvilnea (VCL) y velocidad promedio (VAP).
2. Para los clculos de precisin se trabaj con 3 muestras de semen de diferentes niveles de concentraciones y movilidad, las que fueron analizadas entre 10 y 20 veces en dos tipos de cmaras: Leja 10 (altura 10 m) y Porta-Cubreobjetos (altura 20 m). La repetitibilidad y reproducibilidad se determinaron como el coeficiente de variacin (CV%) intra cmara y entre cmaras, respectivamente (8).
3. Para evaluar el efecto de la profundidad de la cmara en la movilidad espermtica, en 28 muestras de semen de diferentes concentraciones y movilidades, se efectu el anlisis objetivo por duplicado empleando cmaras Lejas de 10 y 20 m de profundidad.

4. Para la estimacin del lmite de deteccin (LD) y lmite de cuantificacin (LQ) se emplearon muestras azoosprmicas (n: 13), (9) (10). El LD fue calculado como la media del blanco +3 DE (desvo estndar) y el LQ como 3 veces el LD.
5. Para determinar el Intervalo de medicin, una muestra de semen de elevada concentracin (125 mill/mL) fue diluida progresivamente empleando pipeta automtica de presin positiva con plasma seminal autlogo libre de clulas (centrifugado y filtrado), hasta llegar a una concentracin de 1 mill/mL (11).
6. La comparacin entre mtodos se llev a cabo con 100 muestras procesadas simultneamente en forma subjetiva y objetiva para movilidad y concentracin (12).
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