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Revista Nº 52 Julio - Agosto 2013

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Investigacin Gacetilla Agenda Arte Bioagenda

Diagnstico Bioqumico


Electroforesis bidimensional en orina: una alternativa para el laboratorio clnico*

Autor: Mara Laura Facio1, Leticia Madalena2, Susana Fraind1, Mariel Alejandre1, Pablo Bresciani1, Marco Bresciani1, Marco Pizzolato2. 1 Bioqumico 2 Doctor en Bioqumica * Departamento de Bioqumica Clnica. Laboratorio de Protenas. INFIBIO

Resumen

En este trabajo se presenta un mtodo confiable para el anlisis de rutina de protenas urinarias. El mtodo es la electroforesis bidimensional que combina la electroforesis en acetato de celulosa con la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio seguida de tincin argntica. La electroforesis bidime-nsional abre el espectro de protenas, siendo algunas de ellas identificadas por immunoblotting o espectrometra de masa MALDI. Dichas protenas son de bajo peso molecular: Orosomucoide (40 kDa), apolipoprotena AI (28 kDa), zinc-alfa 2-glicoprotena (43 kDa), fragmento del perlecan C-terminal LG3 (23 kDa), prostaglandina D2 sintasa tipo-lipocalina (29 kDa) e inter-alfa inhibidor de tripsina cadena pesada H4 (35 kDa). Estas protenas estn incluidas en estudios de falla renal aguda, falla renal crnica, trasplante renal, enfermedad glomerular y enfermedad maligna del tracto urogenital. El mtodo, no invasivo, se aproxima a la tecnologa emergente de la protemica que permite el anlisis simultneo de varias protenas urinarias como una herramienta para el diagnstico y monitoreo de una variedad de enfermedades humanas.

Palabras clave: electroforesis bidimensio-nal en orina * zinc-alfa2-glicoprotena * pptido LG3 * prostaglandina D2 sintasa * inter-alfa-tripsina inhibidor H4 * endotelio vascular

Introduccin

La tecnologa emergente de la protemica permite el examen simultneo de mltiples protenas y su correlacin con el diagnstico, respuesta al tratamiento o pronstico (1). Una de las metodologas que aplica es la electroforesis bidimensional (2D) que combina la separacin de protenas en una primera instancia por isoelectroenfoque y luego por peso molecular en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, permi-tiendo de esta forma una mejor separacin de las protenas, las cuales forman un patrn proteico que puede ser caracteri-zado. La mayora de los estudios para el descubrimiento de biomarcadores han utilizado un mtodo cualitativo, buscando protenas o pptidos que aparezcan o desaparezcan en la muestra de individuos enfermos en comparacin con muestras de individuos sanos, a travs de la electroforesis 2D asociada con espectro-metra de masa y/o identificacin inmuno-qumica de protenas. El descubrimiento de biomarcadores con variada sensibilidad y especificidad es cada vez mayor, no obstante persisten algunos desafos en trasladar estos hallazgos a la prctica clnica (2). Muchos estudios se han enfocado en la identificacin de biomarcadores en enfermedad renal y en enfermedades del tracto urogenital. Ellos incluyen el estudio de injuria renal aguda, rechazo renal agudo, enfermedad glomerular, y enfermedad maligna del tracto urogenital, entre otros (2-5). En pacientes con carcinoma de clulas de transicin se identificaron a las protenas orosomucoide (Oroso) y Zinc alfa-2 glicoprotena (ZAG) como potenciales marcadores tumorales utilizando electro-foresis 2D. Ambas estn incrementadas y la abundancia de estas protenas en orina aumenta con el estadio del tumor (6). Tambin pueden ser utilizadas en enfermedades sistmicas, como pancreatitis aguda, apnea obstructiva del sueo, cncer de ovario temprano y cncer de pulmn (7-10).

En 1989 Lapin et al. proponen la electroforesis bidimensional para uso clnico (2D UC) en el estudio de protenas urinarias, combinando como primer paso la electroforesis en acetato de celulosa y luego la separacin por peso molecular en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y coloracin con Coomassie Blue R 250 (11).

Actualmente, el estudio proteico urinario que se realiza en la prctica clnica es la electroforesis en acetato de celulosa, uroproteinograma (URO), que tiene limitaciones para definir el perfil tubular en comparacin con el SDS-PAGE monodi-mensional (1D) y la cuantificacin de microprotenas urinarias, alfa 1 y beta 2 microglobulinas (12). A su vez, en el seguimiento de pacientes con trasplante renal, el perfil tubular fue mejor evaluado y monitoreado por el mtodo de la electroforesis 2D UC coloreado con tincin argntica (13).

La presente propuesta consiste en utilizar el mtodo de Lapin con coloracin argntica en muestras de orina como una aproximacin al estudio de la protemica para utilidad en el Laboratorio Clnico y para identificar el espectro proteico que se abre en la electroforesis 2D UC.
Materiales y Mtodos

MUESTRAS

Orinas de 24 horas.

PROCEDIMIENTO

Primera dimensin: Acetato de celulosa gelatinizado (Cellogel-Biosystem), buffer veronal pH 8.6; Fi 0,05 (Helena).

Segunda dimensin: Mini protean 3 System Bio-Rad, gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12,5% de concentracin final. Buffer de corrida continuo tris glicina con SDS.

Se realiz la corrida electrofortica de la muestra en primera dimensin en acetato de celulosa por duplicado, una como control de corrida y posicin de las bandas proteicas y otra para la corrida electrofortica vertical en segunda dimensin. Se sembr con sembrador lineal semimicro realizando 3 toques en el punto de siembra para el control, y entre 10 y 20 μL de orina (dependiendo de la concentracin proteica de la muestra) con microjeringa en forma pausada y lineal, de la misma longitud que el sembrador semimicro, para la segunda. Se sembraron aproxima-damente de 2 a 20 μg de protena total. Se realiz la corrida electrofortica en buffer veronal durante 30 min a 200 voltios. La corrida control se coloc en el fijador para continuar la coloracin argntica (14) y la segunda se sumergi inmediatamente en el gel de apilamiento (stacking) antes de su gelificacin. A ambos lados de la tira de acetato se realiza una cavidad para sembrar 10 μL de muestra, diluida al medio con buffer muestra y el control de peso molecular, que corrern en una dimensin (SDS-PAGE clsico, monodimensional, 1D). Se realiz la electroforesis vertical durante 45 min a 200 voltios y luego se procedi a la coloracin argntica (15).
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