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Revista Nº 47 Setiembre - Octubre 2012

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Investigacin Gacetilla Bioqumica Empresarial Agenda Arte Bioagenda

Diagnstico Bioqumico


Primer Consenso Argentino para la Estandarizacin de la Determinacin de Anticuerpos Anti-Nucleares por Inmunofluorescencia Indirecta-HEp-2

Autor: Orlando Gabriel Carballo (1ea), Fernanda Beatriz Ingnito (2a), Alejandra Andrea Ginaca (2b), Patricia Carabajal (3b), Marta Alicia Costa (2c), Jeannette Balbaryski (4d) 1. Bioqumico 2. Bioqumica 3. Mdica 4. Licenciada en Qumica a. Laborat

Resumen. La presencia de anticuerpos antinucleares (AAN) es el denominador comn de muchas enfermedades autoinmunes sistmicas y su significancia clnica depende de la metodologa utilizada en su determinacin. En la actualidad, la inmunofluorescencia indirecta (IFI) utilizando clulas HEp-2 como sustrato es la tcnica ms usada. Siendo un proce-dimiento subjetivo se deben optimizar los mtodos de estandarizacin de las distintas variables involucradas, para asegurar la calidad de los resultados obtenidos. El uso de este sustrato permite la descripcin no slo de patrones de fluorescencia nucleares sino tambin citoplasmticos y de diferentes organelas. El 29 de agosto de 2008 se llev a cabo en Buenos Aires el Primer Consenso Argentino para la Estandarizacin de la Determinacin de AAN por IFI-HEp-2, con la participacin de 28 expertos. Se discutieron los aspectos metodolgicos ms importantes y se decidi llamar a la determinacin anti-cuerpos anti ncleocitoplasmticos. Se consensu la sigla representativa de la determinacin, el nombre en espaol de los diferentes patrones y el uso de controles de calidad internos y externos. La unificacin de criterios llevar a la optimizacin de los resultados y a su correcta interpretacin.

Palabras clave: anticuerpos antinucleares * HEp-2* inmunofluorescencia

Introduccin

La presencia de anticuerpos anti-nucleares (AAN) es el denominador comn de muchas enfermedades autoinmunes sis-tmicas con relevancia clnica demostrada (1-3). La frecuencia de AAN es especial-mente alta en Lupus Eritematoso Sistmico (LES), Sndrome de Sjgren, Esclerodermia, Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo y hepatopatas autoinmunes, entre otras. Su presencia en las distintas patologas tiene valor diagnstico, pronstico y de monito-reo, sin embargo, estos autoanticuerpos tambin estn presentes en infecciones y en individuos sanos (4). Se debe considerar, adems, que el grado de positividad indicado por el ttulo tiene importancia diagnstica, ya que el valor predictivo positivo aumenta a ttulos elevados (5).

La primera referencia histrica de AAN son las clulas LE descriptas por Hargraves, et al. (6) en 1948, cuando, en una puncin de mdula sea, describieron la presencia de fagocitosis de material nuclear intacto opsonizado por autoanticuerpos. El factor responsable del fenmeno de clulas LE result ser una familia de autoanticuer-pos que reconoca diferentes constituyen-tes nucleares.

Al final de la dcada del 50 se desarroll la tcnica de IFI empleando como sustratos cortes criostticos de tejidos (hgado y rin) de roedores (rata o ratn). La positividad de la misma era dada por la presencia de coloracin fluorescente en los ncleos de las clulas. Comparado con la prueba de clulas LE, la IFI demostr ser mucho ms sensible, aunque con una disminucin en la especificidad diagnstica (7-9).

En un esfuerzo por reducir el nmero de falsos positivos o resultados clnicamente irrelevantes, los laboratorios comenzaron a informar los ttulos. En general, los pacientes con LES presentaban ttulos mucho ms altos que los individuos normales o con otras enfermedades. La prueba de AAN positiva fue incorporada como uno de los criterios diagnsticos de LES por el Colegio Americano de Reuma-tologa (10).

El anlisis de los resultados de las pruebas de AAN sobre cortes criostticos de tejidos revelaban diferentes patrones de coloracin nucleares, por lo que los laboratorios comenzaron a informar dichos patrones como: homogneo, moteado, nucleolar o perifrico. Posteriormente fueron incorporadas lneas celulares como sustrato para la deteccin de AAN por IFI, que demostraron tener considerables ventajas sobre la utilizacin de cortes criostticos de tejidos de roedores. La lnea celular ms comnmente utilizada es la HEp-2 proveniente de un carcinoma de laringe humano. Entre las ventajas ms importantes que han llevado a convertir a esta lnea celular en sustrato de referencia para la determinacin de AAN se puede mencionar:

1) Las clulas HEp-2 son ms sensibles porque presentan mayor concentracin de antgenos, por ej: SSA/Ro.
2) Al provenir de un cultivo celular asincrnico, permiten la deteccin de anticuerpos contra mltiples estructuras nucleares, citoplasmticas y relacionadas con la divisin celular.
3) Los ncleos presentan mayor tamao por lo que los patrones de fluorescencia son ms fcilmente visualizables.

Con el objeto de evitar resultados falsos positivos o falsos negativos, los laboratorios deben ajustar perfectamente sus condiciones de trabajo para interpretar los resultados correctamente, en especial buscando la dilucin de corte que permita discernir mejor entre los individuos sanos y los enfermos. De esta manera se mejora el valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN).

Con la utilizacin de HEp-2 la cantidad de patrones observados se ha incrementado con los aos hasta llegar, aproximadamente, a 50, teniendo en cuenta no slo el teido nuclear sino tambin el citoplasmtico y de diferentes organelas como ser mitocondrias, Golgi, nuclolo y distintas estructuras del aparato mittico tales como huso mittico, centrio-los, etc. Esto requiere de profesionales muy entrenados en la interpretacin de imgenes y con conocimientos de biologa celular. Los patrones permiten la orien-tacin en la especificidad antignica del anticuerpo, para luego utilizar un mtodo especfico de identificacin como ELISA, Western Blot, Inmunoensayo Lineal, Dot Blot, Hemoaglutinacin, etc. (11).

Como en otras determinaciones del laboratorio, la deteccin de los anticuerpos antinucleares debe cumplir con indica-ciones estrictas que permitan el asegura-miento de la calidad de los resultados obtenidos. Basados en distintas publica-ciones y guas (12), profesionales e instituciones estn comprometidos en desarrollar sistemas de control de calidad e informar aspectos referidos a la mejor interpretacin de estas pruebas, sobre todo en situaciones clnicas donde los resultados son muy significativos.

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