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Revista Nº 44 Marzo - Abril 2012

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Investigacin Agenda Arte Bioagenda

Diagnstico Bioqumico


Anlisis de lquido cefalorraqudeo por mtodos inmunolgicos y de biologa molecular en el diagnstico de meningitis asptica por Enterovirus

Autor: Guillermo Gabriel Nuez (1), Ariela Soledad Galarza (*), Mara Gabriela Garca (**), Daniel Alberto Pirola, Mara Silvia Prez (2) 1- Bioqumico. Doctor de la Universidad de Buenos Aires. Docente Autorizado e Investigador de la Ctedra de Inmunologa



Introduccin

Los virus ARN de menor tamao conocidos hasta el momento son los picornavirus, de alli deriva su nombre pico=pequeo.
Los picornavirus son los virus ARN de menor tamao que se conocen hasta el momento, de donde deriva su nombre pico=pequeo. El Comit Internacional de Nomenclatura Viral considera que la familia Picornaviridae est constituida por diferentes gneros: Enterovirus, Rinovirus y dos gneros que infectan animales, Aftovirus agente productor de aftosa y Cardiovirus productor de encefalomio-carditis de los roedores.

Los picornavirus poseen caracters-ticas estructurales comunes: tienen un dimetro de 20 a 30 nm, ARN de cadena simple no segmentado y cpside de simetra icosadrica, sin envoltura. El ARN es infeccioso y puede servir de templado para la sntesis de ARN adicional (ARN+) o puede ser encapsidado para formar progenie de viriones. Al carecer de envoltura lipdica son resistentes a los solventes y detergentes que destruyen otros virus. Sin embargo, estos virus se inactivan rpidamente por radiaciones ionizantes, cloro residual, formaldehido y fenol. Los enterovirus son estables a pH cido, lo que les permite luego de la replicacin inicial en orofaringe atravesar estmago e implantarse en el tracto intestinal inferior [1].

El ciclo replicativo de los ente-rovirus es ltico y su receptor celular es una molcula perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas que se presenta en distintos rganos diana, como el corazn (Coxsackievirus), el sistema nervioso central (SNC), el hgado o el intestino.

Se conocen ms de 70 serotipos que causan infecciones, algunas clnicamente inaparentes, que en un pequeo porcentaje de casos, dan origen a enfermedades graves del SNC, como la meningitis asptica, encefalomielitis, ataxia cerebelar, sndrome de Guillain-Barre, mielitis transversa y poliomielitis, entre otras. Determinados enterovirus se asocian con frecuencia a brotes epidmicos, dando lugar a un sndrome especifico, los mismos serotipos pueden, tambin ser responsables de infecciones espordicas, con diferentes manifestaciones clnicas, incluso hasta asintomticas. Por otro lado, diferentes virus pueden producir el mismo sndrome. Por estas razones, en general, las manifes-taciones clnicas no son una base satisfac-toria para el diagnostico (Tabla 1).

El virus penetra en el organismo por va oral o nasofarngea, con un periodo de incubacin que oscila entre 3 y 30-40 das. Se multiplica localmente en el tejido linfoide de la faringe y las placas de Peyer y despus se disemina por va sangunea (viremia primaria) a otros tejidos diana, como la piel, miocardio, meninges, pncreas, etc., donde se replica. Los sntomas pueden ser el resultado directo de la destruccin de las clulas diana en los tejidos (como ocurre en la poliomielitis), o puede deberse a la respuesta inmune frente al virus (como ocurre en el modelo murino de miocarditis por virus Coxsackie B).

La mayora de las infecciones son abortivas, debido a la existencia de anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos IgG, IgM e IgA aparecen con bastante rapidez en el curso de la infeccin. La inmunidad es, predominantemente, humoral, especifica de serotipo y duradera (los anticuerpos persisten durante toda la vida) [2].

La mayora de los enterovirus que son citopatognicos, pueden ser recupe-rados por inoculacin de las muestras en cultivos primarios o de lnea de rin de mono, o de clulas diploides humanas. Para el aislamiento de los serotipos de Coxsackie A que no producen efecto citoptico en cultivos celulares, deben utilizarse ratones lactantes. Un diagnstico presuntivo de infeccin enteroviral puede realizarse, teniendo en cuenta las caractersticas clnicas de la enfermedad, la poca del ao, el sistema celular en el cual el virus se aisl, las caractersticas del efecto citoptico, etc. A pesar de que no existe teraputica antiviral especifica, el reconocer tempra-namente una infeccin enteroviral puede brindar informacin para el manejo del paciente y para reconocer en la comunidad un brote de enfermedad similar [1, 3].

El mtodo ms utilizado para la tipificacin de un enterovirus es la seroneutralizacin con antisueros espe-cficos. Mientras el aislamiento de un ente-rovirus se realiza con rapidez, su identi-ficacin generalmente es lenta y laboriosa. La identificacin del serotipo no tiene una utilidad clnica inmediata; la mayora de las veces, lo importante es determinar con rapidez si se trata de un enterovirus o no, aunque si tiene un importante inters epidemiolgico. Para la mayora de los enterovirus, la identificacin especfica se realiza mediante la neutralizacin (ya mencionada), aunque tambin se utilizan otros tipos de tcnicas como la hemoaglu-tinacin indirecta (HAI), fijacin del complemento (FC) y el enzimoinmu-noanlisis (ELISA). La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es actualmente la forma ms sencilla y rpida de tipificacin de los enterovirus. Es conocido que el ndice de recuperacin de enterovirus por cultivo a partir de LCR es bajo, debido a la escasa concentracin de viriones en la muestra y a la dificultad de crecimiento de algunos serotipos en los cultivos celulares. La deteccin de genoma mediante Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), aporta rapidez, aumento de sensibilidad y posibilidad de deteccin de todos los enterovirus [1, 2, 3, 4].

Teniendo en cuenta los mtodos diagnsticos actualmente empleados para la deteccin de la infeccin por enterovirus, el objetivo del presente trabajo fue detectar, y comparar los resultados obtenidos de la deteccin de anticuerpos mediante un mtodo inmunolgico (IFI) y un mtodo de biologa molecular (PCR en Tiempo Real) que detecta ARN viral, en muestras de lquido cefalorraqudeo pertenecientes a pacientes con diagnstico presuntivo de meningitis asptica.

Materiales y Mtodos

Muestras: Se analizaron 36 muestras de lquido cefalorraqudeo (LCR) provenientes de pacientes con sospecha de meningitis. Las muestras fueron remitidas a la Seccin de Biologa Molecular del laboratorio MANLAB y luego de su anlisis, remitidas a la Seccin de Inmunologa del mismo labo-ratorio. Todas las muestras seleccionadas no provinieron de extracciones traumticas, por lo que se descart la contaminacin con sangre de las mismas. Las muestras fueron mantenidas a -20C hasta el momento de su anlisis.

Deteccin de RNA viral: El RNA viral fue extrado de mues-tras de LCR empleando el reactivo comercial Magna Pure Compact Nucleic Acid Isolation kit (Roche) utilizando el equipo Magna Pure compact system (Roche). Se us como control interno de purificacin y amplificacin CPE-RNA (Nanogen Advanced Diagnostics). El ARN obtenido fue sometido a transcripcin reversa (RT-PCR) empleando random primers mediante el kit comercial High-Capacity cDNA Transrcription Kit (Applied Biosystems) siguiendo las especi-ficaciones del fabricante y empleando un termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems). El cDNA obtenido fue sometido a amplificacin empleando primers especficos del gnero Enterovirus. La amplificacin fue realizada mediante Real Time PCR empleando el kit Enterovirus Q-PCR Alert AmpliPROBE (Nanogen Advan-ced Diagnostics) siguiendo las especifica-ciones del fabricante. La reaccin se llev a cabo en el Step One Real Time PCR System. (Applied Biosystems).

Deteccin de anticuerpos especficos: Se llev a cabo la deteccin de anti-cuerpos especficos para Echovirus y Coxackievirus B mediante Inmunofluores-cencia Indirecta (IFI). Para la deteccin de anticuerpos anti-Coxackievirus, se emplearon improntas conteniendo clulas A549 infectadas con Coxackievirus B1 a B6 (cepas NIH, MBL Bion). Para la deteccin de Echovirus, se emplearon improntas conteniendo una mezcla de clulas A549, LLCMK2, VERO y HeLa infectadas con Echovirus serotipos 4, 6, 9, 11, 30 y 34, variante CoxA 24 (MBL Bion). Las muestras fueron empleadas sin diluir (IgG) siguiendo protocolos de IFI estandarizados en nuestro laboratorio. Las reacciones fueron reve-ladas mediante incubacin con antisueros de cabra monoespecficos anti-IgG, anti-IgM y anti-IgA conjugados a isotiocianato de fluorescena (FITC) adecuadamente diluidos en PBS conteniendo Azul de Evans como contracolor. Para la deteccin de IgM e IgA, las muestras fueron previamente adsor-bidas empleando el adsorbente RF (Biocien-tfica), siguiendo las instrucciones del fabricante. Como control de especificidad, se incluyeron muestras positivas y negativas en cada ensayo. Las muestras fueron anali-zadas en un microscopio de fluorescencia (Nikon) por dos operadores independien-tes.

Resultados y Discusin

El anlisis molecular de las mues-tras de LCR remitidas arroj un 22,2% de positividad. Dado que la reaccin de PCR en Tiempo Real detecta el material genmico viral, se puede deducir que las muestras correspondientes a estos pacientes contenan Enterovirus como probable causante de meningitis asptica. Cabe destacar que en aquellas muestras en donde se obtuvieron resultados negativos, la ausencia de material genmico enteroviral puede ser confirmada, dado que se descarta la presencia de inhibidores por la amplificacin del CPE-RNA utilizado como control interno. En la Figura 1 se muestra una tpica curva obtenida en la reaccin de PCR en Tiempo Real.

La deteccin de anticuerpos espe-cficos para Coxackievirus y/o Echovirus arroj un porcentaje de positividad total del 55,5%. Mediante la tcnica de IFI, se logr detectar la presencia de IgG e IgA especficas en un 55,5% y 5,5% de las muestras respectivamente.
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