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Revista Nº 27 Mayo - Junio 2009

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Bioqumica Empresarial Espacio UAPE RED Investigacin Entrevista Gacetilla Agenda Arte Bioagenda

Diagnstico Bioqumico


Deteccin Cuantitativa del DNA del virus de Hepatitis B

Autor: Dr. Daniel A. Pirola; Jefe de Virologa de MANLAB; E-mail: virologia@emanlab.com.ar









La infeccin por el virus de Hepatitis B (HBV) afecta muchos millones de personas en todo el mundo y la hepatitis viral asociada es considerada un problema de salud pblica mayor en muchas reas. La OMS ha estimado que actualmente 360 millones de personas estn crnicamente infectadas por el virus y el virus ocasiona el 30 % de los casos de cirrosis y el 50 % de los casos de hepatocarcinoma.
En los ltimos aos, un conjunto de nuevas metodologas se han desarrollado para su diagnstico, y como herramienta til en su tratamiento, evolucionando desde la simple deteccin del HBsAg hasta la cuantificacin y caracterizacin del genoma viral. En este aspecto, los mtodos que usan estrategias basadas en la biologa molecular son actualmente aplicados para analizar las donaciones de sangre, diagnosticar infeccin activa, como ayuda en establecer el pronstico, orientar el tratamiento y para verificar la repuesta al mismo.
Los genomas virales estn presentes en cantidades relativamente pequeas en los lquidos biolgicos del organismo por los que, en general, se requiere de metodologas que amplifiquen significativamente su deteccin. Basadas en estos principios se han desarrollado bsicamente dos grandes grupos de ensayos, (a) aquellos que amplifican el DNA viral y (b) aquellos que amplifican la seal de deteccin.
Los mtodos pertenecientes a la categora en el punto a) incluyen a la ya tan conocida tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) con diferentes variantes metodolgicas. Recientemente, una variedad conocida como PCR en tiempo real se ha impuesto por sus ventajas de sensibilidad, rapidez y extensin de su rango dinmico de deteccin. Otras metodologas de amplificacin de la seal descriptas incluyen al NASBA y al TMA (amplificacin mediada por transcripcin), ambas de uso clnico actualmente.
El mtodo basado en el principio del punto b) se conoce como mtodo de branched DNA (bDNA).

Mtodos de cuantificacin

La Figura 1 muestra los ensayos comerciales disponibles localmente para cuantificar HBV DNA incluyendo los rangos dinmicos determinados por los fabricantes. Este rango puede extenderse por dilucin previa de la muestra. Estos ensayos son especficos y exactos dentro del rango dinmico.

La influencia del genotipo en la determinacin de la concentracin de virus en plasma, tambin denominada carga viral (CV), no ha sido extensamente evaluada pero est descripta para el genotipo F y ensayos de PCR. Lo mismo que para otros virus, se recomienda no considerar variaciones en la CV menores a 0.5 log10 como analticamente significativas.
Varios aos atrs los ensayos para cuantificar HBVDNA expresaban los resultados en copias/mL o pg/mL de HBVDNA llevando a notorias diferencias inter mtodos. Recientemente, la OMS estableci un estndar universal para unificar la expresin de los resultados definiendo la Unidad Internacional y es especialmente til en los ensayos desarrollados recientemente que poseen una muy alta sensibilidad (entre 50 y 100 UI/mL). Este estndar est basado en el genotipo A y la Unidad Internacional es equivalente a aproximadamente 5.4 equivalente de genoma o copias virales. An as es posible encontrar para una misma muestra variaciones entre los resultados obtenidos por metodologas estandarizadas por lo que se recomienda el seguimiento comparativo de resultados de un paciente por la misma metodologa.


Aplicaciones
Algunas de las aplicaciones de la cuantificacin de la carga viral se encuentran en la Figura 2.
Bancos de sangre: Los ensayos de carga viral no se realizan universalmente en el Banco de Sangre aunque numerosos estudios realizados demuestran que la deteccin del HBVDNA es aproximadamente 21 das anterior a la aparicin del HBsAg en la deteccin de la infeccin reciente. An cuando se desee disminuir el riesgo de transmisin de HBV la deteccin cualitativa sera suficiente.

Diagnstico de la infeccin por HBV: Los ensayos serolgicos son normalmente suficientes para el diagnstico de la infeccin aguda por HBV. La infeccin crnica se define como la persistencia del HBsAg en suero por ms de 6 meses.
En esas circunstancias la cuantificacin de HBVDNA es necesaria para determinar el grado de replicacin viral y correlacionarlo con la presencia o ausencia de HBeAg, con las alteraciones bioqumicas e histolgicas y la actividad de fibrosis.
En presencia de HBeAg el diagnstico de infeccin crnica replicativa puede realizarse independientemente del nivel de CV. En los casos de HBeAg negativos o anti-HBe positivos (situacin que se asocia a la presencia de virus con mutaciones en la regin pre core del genoma viral) la CV viral es el nico marcador de replicacin. La diferenciacin entre estos pacientes y los portadores inactivos es difcil, pues se pueden observar en ambos casos muy bajos niveles de CV.
Con los nuevos mtodos que pueden detectar CV muy pequeas se hizo necesario definir niveles significativos de replicacin, es aceptado que CV inferiores a 100 UI/mL se asocian a portadores inactivos mientras que concentraciones mayores deben asociarse a replicacin viral activa.

Severidad y Pronstico

Si bien el examen histolgico del hgado es la mejor forma de evaluar la severidad de la hepatitis crnica por HBV la deteccin de HBVDNA aporta una valiosa informacin pronostica. En hepatitis crnica B (CHB) niveles elevados de HBVDNA se asocian con un riesgo aumentado de progresin de esta a formas ms severas como cirrosis o hepatocarcinoma. Este riesgo es bajo si la hepatitis crnica est asociada a bajas CV pero esta conclusin carece de valor cuando la consideramos en casos de cirrosis.

Tratamiento

La CV de HBVDNA es de vital importancia en el tratamiento de la infeccin por HBV tanto como en la decisin del tratamiento, seleccin de la teraputica ptima, control de la efectividad y seguimiento de la aparicin de mutaciones de resistencia a los antivirales anlogos de nucletidos o nuclosidos. En la Figura 3, se describen los parmetros habituales para evaluar una (...)
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