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Revista Nº 14 Marzo - Abril 2007

Sumario Editorial Diagnstico Bioqumico Investigacin Calidad Espacio UAPE RED Espacio CUBRA Gacetilla Agenda Arte Bioagenda

Investigacin


Aplicacin de PCR-RFLP para subtipificar Campylobacter Jejuni

Autor: G. Giacoboni1*, M.G. Echeverra2, C. Perfumo3 1Laboratorio de Diagnstico e Investigaciones Bacteriolgicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata. 60 y 118 CC296 (B11900AVW) La Plata, Argentina. 2Ctedra de Virologa CONICE





Desde que Vandamme en 1991 propuso a la familia Campylobacteraceae como superfamilia VI de acuerdo con los estudios de rRNA, una amplia variedad de subespecies se definieron tanto en el gnero Campylobacter como en el gnero Arcobacter (12). Las especies C. jejuni y C. coli son una de las causas de enteritis aguda en humanos, siendo los animales domsticos y silvestres, en particular las aves, los reservorios de C. jejuni, y los cerdos de C. coli (1). Los alimentos de origen animal (carne de aves, cerdo) hacen de esta zoonosis una enfermedad transmitida por alimentos (ETA), entre otras maneras de transmitirse al humano.
Estas bacterias tienen escasa actividad bioqumica. Al no fermentar los hidratos de carbono, se utilizan pruebas de tolerancia a diferentes temperaturas, la prueba de la hidrlisis del hipurato e hidrlisis del indoxil acetato, la sensibilidad a discos de 30 g de cido nalidxico y cefalotina, y segn la especie a identificar la tolerancia a diferentes concentraciones de sustancias como NaCl, glicina, etc. Son pocos los mtodos fenotpicos (serotipificacin, biotipificacin, tipificacin por fagos) que discriminen satisfactoriamente una especie o subespecie. Este inconveniente se exacerba porque todos ellos revelan una enorme diversidad (10).
Actualmente, la Biologa Molecular aporta una amplia variedad de tcnicas para subtipificar genotpicamente a Campylobacter spp. Algunas de ellas se basan en la digestin por enzimas de restriccin de productos de PCR (PCR-RFLP) (4), en la amplificacin al azar del ADN polimrfico (RAPD) (7), ribotipificacin (3) o la electroforesis en geles de agarosa con campo pulsado (PFGE) (2, 8).
Dentro de la gran oferta de posibilidades de las tcnicas de Biologa Molecular, la eleccin depende del objetivo del trabajo y las posibilidades de poder acceder a ellas, pues requieren un equipamiento especial y altos costos en los elementos que se utilizan para realizarlas. A lo anterior habra que sumarle que no hay una prueba de oro incuestionable que se utilice como referencia, por lo que las variaciones en los resultados que se obtienen por las diferentes pruebas aplicadas dificultan su interpretacin (13).
La tcnica de PCR-RFLP para el gen flaA se basa en la amplificacin del gen de la flagelina por PCR, seguida por la digestin por enzimas de restriccin que generen fragmentos. La diferencia en la distribucin de los sitios de restriccin en los genes fla entre las cepas generar fragmentos de diferente tamao y por lo tanto un modelo de banda diferente, que se visualizar cuando se los separa por electroforesis (4).
El objetivo de este trabajo fue aplicar una tcnica de Biologa Molecular accesible, con la que pudiramos subtipificar las especies de Campylobacter jejuni de origen porcino obtenidas de diferentes establecimientos (cuatro), e identificadas previamente por pruebas bioqumicas.
A 10 cepas aisladas de abortos porcinos e identificadas bioqumicamente como C. jejuni I de Lior (dos cepas, denominadas F3 y F4), C. jejuni II de Lior (ocho cepas denominadas F1, F2, F5, F6, F8, F9, F10 y F11) (6) se les extrajo el ADN por el mtodo de fenol/cloroformo/isoamilalcohol (5) y la cuantificacin se realiz en espectrofotmetro. El ADN obtenido se diluy con agua destilada estril hasta obtener una concentracin final de 20 ng/L.
Para la reaccin en cadena de la polimerasa se utilizaron los cebadores para amplificar ...
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